SN∕T 3306.17-2021 国境口岸环介导等温扩增（LAMP)检测方法 第17部分：包虫
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ID： |
D5CB589E850C4A6C9B17F965A4640076 |
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文件大小(MB)： |
0.26 |
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12 |
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日期： |
2021-10-24 |
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ICS11.020,CCS C62,中华人民共和国出入境检验检疫行业标准,SN/T3306.17—2021,国境口岸环介导等温扩增(LAMP)检测,方法 第17部分:包虫,Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port ———,Part 17:Hydatid,2021-06-18发布2022-01-01实施,中华人民共和国海关总署发布,前 言,本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定,起草,本 文件为SN/T 3306—2021《国境口岸环介导等温扩增(LAMP)检测方法》的第17 部分,SN/T 3306已发布以下部分,———第1部分:鼠疫杆菌;,———第2部分:产毒素霍乱弧菌;,———第3部分:志贺氏菌;,———第4部分:嗜肺军团菌;,———第5部分:布鲁氏菌;,———第6部分:黄热病毒;,———第7部分:猴痘病毒;,———第8部分:基孔肯雅病毒;,———第9部分:结核分枝杆菌;,———第10部分:炭疽芽孢杆菌;,———第11部分:副溶血性弧菌;,———第12部分:空肠弯曲菌;,———第13部分:疟原虫;,———第14部分:大肠杆菌O157:H7;,———第15部分:沙门氏菌;,———第16部分:寨卡病毒:,———第17部分:包虫,请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任,本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口,本文件起草单位:中华人民共和国成都海关、中华人民共和国福州海关,本文件主要起草人:田绿波、刘杨、高国龙、黄恩炯、常晓松、辛文瀚、王俊贤,Ⅰ,SN/T3306.17—2021,国境口岸环介导等温扩增(LAMP)检测,方法 第17部分:包虫,1 范围,本文件规定了国境口岸检测包虫病疑似样本中包虫的环介导等温扩增(LAMP)方法,本文件适用于国境口岸包虫的筛选检测,2 规范性引用文件,下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文,件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于,本文件,GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法,GB 19489 实验室 生物安全通用要求,SN/T 1193 基因检验实验室技术要求,WS/T 230 临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用,3 术语和定义,本文件没有需要界定的术语和定义,4 缩略语,下列缩略语适用于本文件,Bst酶:Bst DNA 聚合酶(大片段)[Bst DNA polymerase (large fragment)],DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid),dNTP:脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate),EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid),LAMP:环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification),Triton X-100:聚乙二醇辛基苯基醚,5 技术概要,LAMP是一种连续、恒温、基于酶反应的核酸扩增技术。根据包虫的特异性序列基因设计特异性,内引物、外引物各一对,在特异性识别靶序列上的独立区域,利用Bst酶启动循环链置换反应。在特异,性基因序列区启动互补链合成,结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环,DNA 混合物。LAMP反应过程中,从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+ 结合,产生副,产物(焦磷酸镁)形成乳白色沉淀,加入显色液,即可通过肉眼观察判定结果。亦可加入显色液,通过颜,色变化观察判定结果,1,SN/T3306.17—2021,6 生物安全和PCR 防污染要求,实验室生物安全应符合GB 19489的规定。PCR防污染措施按SN/T 1193和WS/T 230的规定,执行,7 试剂和材料,除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水符合GB/T 6682中一级水的要求,7.1 引物:根据包虫特有线粒体DNA COl的靶序列基因设计一套特异性引物,包括外引物1,外引物,2,内 引物1,内引物2,外引物(F3,5’-3’)1:GGTTTGGGAATTATTTATTGCCT,外引物(B3,5’-3’)2:CCAAATGCAGAGAAAACATCAA,内引物(FIP,5’-3’)1:GGAATCAAAAGTCAAGCACTCAAAGTGTTAGGTGGGTTGTCTGA,内引物(BIP,5’-3’)2:AGTATGTGTTTAGGGGVTGGTTAGAAAAATTACGACGAGGACA,7.2 DNA 提取液:含20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、2 mmol/L EDTA 和1.2% Triton X-100或组,织提取试剂盒,7.3 dNTPs:每种核苷酸浓度10 mmol/L,7.4 Bst酶:8 U/μL,7.5 10×ThermoPol缓冲液:含200 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)、100 mmol/L (NH4 )2SO4、,100 mmol/L KCl、20 mmol/L MgSO4、1% Triton X-100,7.6 MgSO4 溶液:25 mmol/L,7.7 甜菜碱:5 mol/L,7.8 显色液:浓度为1 000× SYBR Green Ⅰ,7.9 0.2……
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